Strukturę psylocybiny opisano w 1958 roku. Przez następne pięćdziesiąt dziewięć lat nikt nie potrafił powiedzieć, jak grzyb ją składa — które białka wykonują kolejne kroki i w jakiej kolejności. Że powstaje z tryptofanu, wiedziano od lat sześćdziesiątych. Pytanie brzmiało: czym.
Odpowiedź opublikował w 2017 roku zespół z Jeny. Cząsteczkę buduje czwórka enzymów, geny wszystkich czterech leżą w genomie obok siebie, a punktem wyjścia jest aminokwas, który każda komórka grzyba ma i tak pod ręką.
Punkt wyjścia to L-tryptofan, nie żadna egzotyczna cząsteczka
Psylocybina należy do tryptamin, więc jej szkielet — pierścień indolowy z bocznym łańcuchem — jest dokładnie tym samym szkieletem, który nosi tryptofan. Grzyb nie buduje go od zera. Bierze gotowy aminokwas i nakłada na niego cztery modyfikacje: odcina fragment, dokłada tlen, przypina fosforan, dwa razy metyluje azot.
Ustalono to na długo przed erą sekwencjonowania. W 1968 roku Stig Agurell i J. Lars G. Nilsson podawali kulturom grzybów znakowane izotopowo pochodne tryptaminy i sprawdzali, które z nich odnajdą się w gotowym produkcie. Taka metoda pokazuje, co leży po drodze. Nie pokazuje, kto wykonuje robotę.
Cztery enzymy, cztery kroki: PsiD, PsiH, PsiK, PsiM
Komplet scharakteryzowali w 2017 roku Janis Fricke, Felix Blei i Dirk Hoffmeister z Uniwersytetu Friedricha Schillera w Jenie. W jednym z doświadczeń złożyli psylocybinę poza grzybem, mieszając trzy z tych enzymów z 4-hydroksy-L-tryptofanem.
PsiD odcina grupę karboksylową
Pierwszy krok to dekarboksylacja: z L-tryptofanu powstaje tryptamina. Odpowiada za nią PsiD, który — jak napisali autorzy — reprezentuje nową klasę grzybowych dekarboksylaz L-tryptofanu. Enzymu o takiej roli wcześniej w tej grupie organizmów nie znano.
PsiH dokłada tlen w pozycji czwartej
Drugi krok wykonuje monooksygenaza PsiH i to on rozstrzyga o tożsamości cząsteczki. Grupa hydroksylowa siada w pozycji 4 pierścienia indolowego. Serotonina, z którą psylocybinę zestawia się przy każdej okazji, ma tę samą grupę w pozycji 5. Cała różnica to jedno miejsce.
PsiK przypina fosforan
Kinaza PsiK przenosi resztę fosforanową na świeżo powstałą grupę hydroksylową. Produktem jest norbaeocystyna — nie ciekawostka nazewnicza, tylko pełnoprawny półprodukt szlaku.
PsiM metyluje azot dwa razy
Na koniec metylotransferaza PsiM dwukrotnie przenosi grupę metylową z S-adenozylometioniny na azot w łańcuchu bocznym. Po pierwszej rundzie powstaje baeocystyna, po drugiej — psylocybina. Autorzy opisali tę iteracyjną metylację jako krok terminalny, czyli ostatni w całym szlaku.
Zaskoczeniem była kolejność, nie same reakcje
Cztery reakcje daje się w zasadzie odczytać ze wzoru gotowego produktu. Kolejności — nie. Grzyb przypina fosforan, zanim skończy metylację, więc przez dwa ostatnie kroki nosi ester fosforanowy na cząsteczce, która nie jest jeszcze gotowa. Wygląda to na marnotrawstwo, dopóki nie spojrzy się, co ten fosforan robi.
Różnicę między psylocybiną a psylocyną robi dokładnie ta grupa: forma pozbawiona fosforanu jest reaktywna i nietrwała. Praca zespołu z Jeny nad reakcją sinienia, opublikowana w 2020 roku, wprost sugeruje, że ester fosforanowy pełni funkcję odwracalnej grupy ochronnej. Grzyb magazynuje związek w postaci, która nie utleni mu się w komórce.
Co dzieje się ze szlakiem, gdy grzyb zostanie uszkodzony
Ta sama praca pokazała drugą stronę układu. Po zranieniu tkanki wchodzą do gry dwa kolejne enzymy: fosfataza PsiP zdejmuje fosforan, dając psylocynę, a lakaza PsiL utlenia jej grupę hydroksylową. Powstałe fragmenty łączą się w mieszaninę oligomerów — analizy wskazały przede wszystkim trzy- do trzynastomerów. Rok później ten sam zespół poprawił własne przypisanie: za sam błękit odpowiada nie oligomer sprzęgany przez atom węgla C-5, jak pierwotnie sądzono, lecz chinoidowy dimer psylocyny sprzęgany przez C-7. Samo sinienie nie jest przy tym testem na psylocybinę, bo inne grzyby niebieszczeją z zupełnie innych powodów.
Geny leżą obok siebie i mają własny transporter
U grzybów geny szlaków metabolizmu wtórnego często siedzą razem, w jednym odcinku chromosomu. Tak jest i tutaj. Zespół Jasona Slota z Ohio State University zsekwencjonował w 2018 roku genomy trzech gatunków — Psilocybe cyanescens, Gymnopilus dilepis i Panaeolus cyanescens — i opisał klaster złożony z czterech genów enzymatycznych oraz jednego lub dwóch genów transporterów z rodziny MFS.
Ten transporter mówi coś o funkcji: komórka nie tylko produkuje związek, ale ma też etatowy mechanizm wyprowadzania go na zewnątrz.
Ten sam klaster u grzybów, które nie są blisko spokrewnione
Grzyby produkujące psylocybinę są rozrzucone po drzewie rodowym pieczarkowców w sposób, którego zwykłe dziedziczenie nie tłumaczy. Slot i współpracownicy zaproponowali wyjaśnienie: klaster wędrował poziomo, między liniami, które łączyło nie pokrewieństwo, lecz wspólna nisza — grzyby odchodowe i późne stadia rozkładu drewna, czyli środowiska, w których o zasoby konkuruje się z bezkręgowcami. Po co grzybowi cząsteczka działająca na receptory serotoninowe kręgowców, pozostaje pytaniem otwartym.
PNAS 2024: sześćdziesiąt siedem milionów lat i dwa układy genów
W styczniu 2024 roku zespół Alexandra Bradshawa i Bryna Dentingera z Uniwersytetu Utah opublikował w PNAS filogenomikę całego rodzaju Psilocybe, zbudowaną na materiale z kolekcji muzealnych: 71 metagenomów, w tym 23 okazy typowe, oraz analizę 2983 rodzin genów jednokopijnych.
Według tej rekonstrukcji linia rodzaju wyodrębniła się około 67 mln lat temu, a różnicowała od mniej więcej 56 mln. Biosynteza psylocybiny powstała najpierw wewnątrz Psilocybe, skąd cztery lub pięć razy przeszła poziomo do innych grzybów, między 40 a 9 mln lat temu. Najciekawsze jest jednak co innego: w klastrze występują dwa różne układy genów, odpowiadające głębokiemu podziałowi wewnątrz rodzaju. Autorzy dopuszczają, że Psilocybe nabyło ten klaster dwukrotnie i niezależnie.
Podstawa takich wniosków bywa cienka: w chwili publikacji sekwencję klastra znano dla pięciu z około 165 gatunków rodzaju, a cztery z tych pięciu należały do jednej z dwóch głównych gałęzi. Psylocybinę wytwarza przy tym więcej rodzajów grzybów, niż sugeruje potoczna nazwa.
Ten sam szlak przepisany do bakterii i do drożdży
Skoro genów jest cztery, można je przenieść gdzie indziej. W 2019 roku zespół Jasona Jonesa z Miami University uruchomił szlak w Escherichia coli: hodowla z zasilaniem dała 1,16 g/l psylocybiny, najwyższy wówczas wynik dla organizmu rekombinowanego. Rok później grupa Iriny Borodiny z Duńskiego Uniwersytetu Technicznego zrobiła to samo w drożdżach piekarniczych, uzyskując 627 ± 140 mg/l. W hodowli pojawiły się też półprodukty szlaku, baeocystyna i norbaeocystyna, oraz związki pokrewne, w tym norpsylocyna i aeruginascyna.
Biologiczny wniosek z obu prac jest ten sam: cztery geny wystarczą, reszta to inżynieria procesu — prowadzona w laboratoriach farmaceutycznych i pod zezwoleniami.
Skąd wziął się PsiM i czego prawdopodobnie nie potrafi
Najdziwniejszą rzecz o tym szlaku opublikowano w marcu 2024 roku w Nature Communications. Zespół z Innsbrucka, Jeny i Colorado School of Mines rozwiązał strukturę PsiM w rozdzielczości 0,9 Å, zatrzymując enzym na kolejnych etapach cyklu reakcji. Analiza strukturalna i filogenetyczna wskazuje, że PsiM wywodzi się z metylotransferaz RNA z rodziny METTL16 — enzymów modyfikujących adeninę w RNA. Wspiera to obserwacja, że związane substraty fizykochemicznie naśladują RNA.
Enzym odpowiadający za najbardziej znaną cechę tych grzybów jest więc przerobionym narzędziem od czegoś zupełnie innego. Zdaniem autorów to dziedzictwo go ogranicza: rusztowanie po monometylotransferazie obniża wydajność składania psylocybiny i nie pozwala na trzecią metylację, prowadzącą do aeruginascyny.
Tu źródła się rozjeżdżają. W pracy drożdżowej z 2020 roku autorzy postawili hipotezę odwrotną i po wprowadzeniu wielu kopii genu psiM zaobserwowali dwudziestojednokrotny wzrost sygnału odpowiadającego zdefosforylowanej aeruginascynie. To nie jest jednak ta sama obserwacja: jedna praca opisuje sygnał analityczny w komórce drożdży z silnie nadprodukowanym enzymem, druga — zachowanie oczyszczonego białka w krysztale. Rozstrzygnięcia na razie nie ma.
Co o grzybach psylocybinowych mówi polskie prawo
Wszystko powyżej to biochemia. Prawo pyta o co innego i odpowiada własnym językiem, więc te dwa porządki trzymamy osobno.
Ustawa z 29 lipca 2005 r. o przeciwdziałaniu narkomanii posługuje się wykazami, które minister zdrowia wydaje rozporządzeniem na podstawie art. 44f. W obowiązującym rozporządzeniu z 17 sierpnia 2018 r. psylocybina i psylocyna figurują w grupie I-P, pod najostrzejszym reżimem kontroli. Zakres obejmuje też preparat, czyli zgodnie z art. 4 pkt 17 produkt zawierający co najmniej jeden środek odurzający lub substancję psychotropową. Dojrzałe owocniki gatunków psylocybinowych są takim materiałem i nikt z tym nie polemizuje.
Doprowadzenie grzybni do owocnikowania jest w Polsce nielegalne. Przepis o uprawie, art. 63, wymienia wyłącznie mak, konopie i krzew koki, więc bywa przywoływany błędnie; zastosowanie znajduje art. 4 pkt 35, definiujący wytwarzanie jako czynności, za pomocą których mogą być otrzymywane substancje z wykazu, wraz z art. 53. Dlatego na tym blogu nie ma opisu, jak takie owocnikowanie wywołać. To nie jest pominięty szczegół techniczny, tylko granica, której nie przekraczamy.
Zestawy hodowlane dostępne w sprzedaży to materiał do obserwacji mikroskopowych i pracy badawczej: podłoże, grzybnia i osprzęt. Za zgodność własnego postępowania z prawem odpowiada osoba, która taki materiał nabywa. Ten tekst opisuje biochemię grzyba i nie jest poradą prawną. Treść dla osób pełnoletnich.
Najczęstsze pytania
Ile enzymów potrzeba, żeby powstała psylocybina?
Cztery: PsiD, PsiH, PsiK i PsiM. Wykonują kolejno dekarboksylację, hydroksylację w pozycji 4, fosforylację i podwójną metylację azotu, startując od L-tryptofanu.
Czy grzybnia ma te same geny co owocnik?
Tak — klaster psi jest częścią genomu, więc znajduje się w każdej komórce organizmu. Obecność genu nie oznacza jednak, że produkt się gromadzi: to zależy od ekspresji i metabolizmu tkanki, a nie od samego posiadania sekwencji.
Dlaczego grzyb dokłada fosforan, skoro aktywna jest dopiero psylocyna?
Ester fosforanowy najprawdopodobniej pełni funkcję odwracalnej grupy ochronnej; sugerują to badania nad reakcją sinienia z 2020 roku. Psylocyna łatwo się utlenia, forma ufosforylowana jest trwalsza.
Skąd wiadomo, że klaster przeszedł poziomo między gatunkami?
Z rozbieżności między drzewem rodowym grzybów a rozmieszczeniem klastra: gatunki produkujące psylocybinę nie tworzą jednej gałęzi. Analizy z 2018 i 2024 roku niezależnie wskazują na transfer poziomy, a ta druga umieszcza źródło szlaku w rodzaju Psilocybe.
Źródła
- Enzymatic Synthesis of Psilocybin — J. Fricke, F. Blei, D. Hoffmeister, Angewandte Chemie International Edition 56(40): 12352–12355, 2017
- Methyl transfer in psilocybin biosynthesis — J. Hudspeth, K. Rogge, S. Dörner, M. Müll, D. Hoffmeister, B. Rupp, S. Werten, Nature Communications 15, 2024
- Injury-Triggered Blueing Reactions of Psilocybe Magic Mushrooms — C. Lenz, J. Wick, D. Braga, M. García-Altares i in., Angewandte Chemie International Edition 59(4): 1450–1454, 2020
- Structure Elucidation and Spectroscopic Analysis of Chromophores Produced by Oxidative Psilocin Dimerization — C. Lenz, S. Dörner, A. Sherwood, D. Hoffmeister, Chemistry — A European Journal 27: 12166–12171, 2021 (korekta przypisania C-5 na C-7)
- Horizontal gene cluster transfer increased hallucinogenic mushroom diversity — H. T. Reynolds, V. Vijayakumar, E. Gluck-Thaler, H. B. Korotkin, P. B. Matheny, J. C. Slot, Evolution Letters 2(2): 88–101, 2018
- Phylogenomics of the psychoactive mushroom genus Psilocybe and evolution of the psilocybin biosynthetic gene cluster — A. J. Bradshaw, V. Ramírez-Cruz, A. R. Awan, G. Furci, L. Guzmán-Dávalos, B. T. M. Dentinger, PNAS 121(3), 2024
- In vivo production of psilocybin in E. coli — A. M. Adams, N. A. Kaplan, Z. Wei i in., Metabolic Engineering 56: 111–119, 2019
- Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the de novo production of psilocybin and related tryptamine derivatives — N. Milne, P. Thomsen, N. Mølgaard Knudsen, P. Rubaszka, M. Kristensen, I. Borodina, Metabolic Engineering 60: 25–36, 2020
- Biosynthesis of Psilocybin. Part II. Incorporation of Labelled Tryptamine Derivatives — S. Agurell, J. L. G. Nilsson, Acta Chemica Scandinavica 22: 1210–1218, 1968
- Ustawa z dnia 29 lipca 2005 r. o przeciwdziałaniu narkomanii — tekst jednolity — Dz.U. 2023 poz. 1939 (art. 4 pkt 17 i 35, art. 44f, art. 53, art. 63)
- Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 17 sierpnia 2018 r. w sprawie wykazu substancji psychotropowych, środków odurzających oraz nowych substancji psychoaktywnych — tekst jednolity — Dz.U. 2024 poz. 1139 (grupa I-P)
